ΠΕ 1. Μελέτη του κύκλου ζωής και ανάπτυξη πρωτοκόλλου καλλιέργειας επιλεγμένων δερματωδών φαιοφυκών των Ελληνικών θαλασσών
Η επιλογή κατάλληλων στελεχών καφέ (φαιοφυκών) δερματωδών μακροφυκών θα γίνει στην βάση της σύστασής τους σε φυκοκολλοειδή (φουκάνες, φουκοϊδάνες), την διαθεσιμότητά τους σε προσβάσιμους φυσικούς βιότοπους και το δυναμικό καλλιέργειάς τους (αύξησης και απόδοσης σε τεχνητές συνθήκες). Για την ανάπτυξη πρωτοκόλλου εντατικής παραγωγής είναι απαραίτητο να μελετηθεί ο κύκλος ζωής των επιλεγμένων μακροφυκών στο πεδίο, να προσδιοριστούν οι βέλτιστες συνθήκες φωτοσύνθεσης και αύξησης μέσω παραγοντικών πειραμάτων, και να δημιουργηθούν καθαρές καλλιέργειες ενός τουλάχιστον είδους/στελέχους.
Θαλλοί σε πρόσφορη κατάσταση θα μεταφερθούν εποχικά από φυσικούς βιότοπους στο εργαστήριο, όπου θα μελετηθεί η φυσιολογική κατάσταση και ο κύκλος ζωής τους (αυξητικά και αναπαραγωγικά στάδια), ενώ σε συνεργασία με τον φορέα ΕΚΠΑ-ΦΑΡΜ θα πιστοποιηθεί η σύστασή τους (φουκοϊδάνες, φουκάνες, αλγινικά οξέα επί του ξηρού βάρους). Η φυσιολογική κατάσταση των μακροφυκών θα μελετηθεί μέσω της φωτοσυνθετικής απόδοσης (Fv/Fm, ETR, παράμετροι JIP ελέγχου) και της συγκέντρωσης των φωτοσυνθετικών χρωστικών (Chl-a, Chl-c, καροτενοειδή). Γόνιμοι θαλλοί διαφορετικών φάσεων του κύκλου ζωής των υπό μελέτη μακροφυκών θα μεταφερθούν από τη φύση σε ελεγχόμενες συνθήκες εργαστηρίου στο ΙΝΑΛΕ, με σκοπό την απελευθέρωση, μετά από τεχνητή καταπόνηση (stress) για τη δημιουργία αρτίβλαστων σε αποστειρωμένο θρεπτικό μέσο. Επίσης, μικρά επάκρια τμήματα των θαλλών θα καθαριστούν και θα απομακρυνθούν επίφυτα και άλλοι ξενοβιώτες ούτως ώστε να προκύψουν καθαροί θαλλοί. Με το υλικό αυτό θα πραγματοποιηθούν παραγοντικά πειράματα προσομοίωσης με σκοπό τη μελέτη της επίδρασης του κλίματος (π.χ. θερμοκρασίας) και της ποιότητας των απορροών του ιχθυογεννητικού σταθμού (π.χ. αλατότητα, θρεπτικά άλατα και θολερότητα-ακτινοβολία), στη φωτοσύνθεση και αύξηση των αρτίβλαστων. Επίσης, θα γίνει προσπάθεια αύξησης των αρτίβλαστων και μεταφορά τους σε υγρές καλλιέργειες σε κωνικές φιάλες σε διαφορετικές συνθήκες (φωτισμού, αλατότητας, θρεπτικά μέσα καλλιέργειας) και θα παρακολουθηθεί η ανάπτυξη και αύξησή τους σε ώριμα θαλλόφυτα, καθώς και το περιεχόμενο σε φυκοκολλοειδή. Αφού διαπιστωθούν οι ακριβείς συνθήκες για την βέλτιστη ανάπτυξη και αύξηση των θαλλών, αυτές θα αποτελέσουν το κατ’ αρχήν πρωτόκολλο καλλιέργειας σε μαζική, εντατική κλίμακα.
ΠΕ 2. Ανάπτυξη πρωτοκόλλων παραλαβής και απομόνωσης πολυσακχαριτών από την βιομάζα των μακροφυκών – Χημική ανάλυση και καθορισμός των φυσικοχημικών ιδιοτήτων των πολυσακχαριτών
Αρχικά στελέχη φαιοφυκών, τα οποία αναπτύσσονται πέριξ των εγκαταστάσεων του φορέα KEFISH, θα συλλεχθούν σε μικρές ποσότητες από τον φορέα ΕΚΠΑ-ΦΑΡΜ ώστε να μελετηθεί ο τρόπος συντήρησης/αποθήκευσης/επεξεργασίας της βιομάζας και ο αποδοτικότερος τρόπος εκχύλισης, παραλαβής και καθαρισμού των πολυσακχαριτών. Έμφαση θα δοθεί στην επιλογή ήπιων συνθηκών επεξεργασίας που θα έχουν το μικρότερο δυνατόν περιβαλλοντικό αποτύπωμα και θα μπορούν να εφαρμοστούν μελλοντικά σε βιομηχανική κλίμακα. Παράλληλα, ποσότητες από τις συλλογές μακροφυκών θα παραληφθούν από τον φορέα ΙΝΑΛΕ ώστε να αξιολογηθούν ως προς τη σύσταση τους σε πολυσακχαρίτες (φουκοϊδάνες, φουκάνες, αλγινικά οξέα επί του ξηρού βάρους). Επιπλέον, ποσότητες από τα καλλιεργημένα στις εγκαταστάσεις του φορέα KEFISH μακροφύκη από τα διάφορα στάδια ανάπτυξης τους θα μελετηθούν ως προς τη σύσταση τους σε πολυσακχαρίτες και θα γίνει σύγκριση με τα δεδομένα από τους φυσικούς πληθυσμούς.
Οι πολυσακχαρίτες που θα παραληφθούν θα μελετηθούν με χημικές και φασματοσκοπικές μεθόδους. Συγκεκριμένα, ο αριθμός των θειικών εστέρων θα προσδιορισθεί σύμφωνα με τη μέθοδο των Kawai, Seno & Anno. Ο αριθμός των ουρονικών οξέων θα προσδιορισθεί με τη μέθοδο του m-υδροξυ-διφαινυλίου. Ο ολικός αριθμός σακχάρων θα προσδιορισθεί φωτομετρικά με τη μέθοδο της φαινόλης-θειϊκού οξέος. Τα ουδέτερα σάκχαρα θα προσδιορισθούν μετά από υδρόλυση με τριφθοροξικό οξύ. Οι μονοσακχαρίτες θα χαρακτηριστούν με αέριο χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (GC-MS) ως τα ακετυλιωμένα παράγωγα τους. Η κατανομή μοριακών μεγεθών των πολυσακχαριτών θα προσδιορισθεί με χρωματογραφία μοριακού αποκλεισμού (HPLC-SEC). Ακόμη, θα γίνει προσδιορισμός της υγρασίας και της τέφρας, καθώς και περιεκτικότητας σε πρωτεΐνες, του ιξώδους και της διαλυτότητας τους. Επιπλέον, οι πολυσακχαρίτες θα αναλυθούν με φασματοσκοπία Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (NMR), με φασματοσκοπία Υπερύθρου μετασχηματισμού Fourier (FTIR), με θερμοβαρυμετρική ανάλυση (TGA) και με διαφορική θερμιδομετρία σάρωσης (DSC).
ΠΕ 3. Εγκατάσταση μακροφυκών, προσαρμογή πρωτοκόλλων και πιλοτική παραγωγή βιομάζας
Ο φορεάς KEFISH θα επιδιώξει την εντατική παραγωγή ενός τουλάχιστον είδους θαλάσσιου φαιοφύκους πλούσιου σε θειικούς πολυσακχαρίτες. Συγκεκριμένα, σε υφιστάμενο ειδικό χώρο εξοπλισμένο με κινητό στέγαστρο θα γίνεται η παραγωγή των μακροφυκών σε δεξαμενές με συνεχή ροή θαλασσινού νερού σταθερής θερμοκρασίας και καθαρότητας. Το πρωτόκολλο παραγωγής θα είναι αυτό που θα προταθεί από τον φορέα ΙΝΑΛΕ, ενώ η επιλογή του στελέχους/είδους θα βασισθεί και στα δεδομένα του φορέα ΕΚΠΑ-ΦΑΡΜ ως προς τη περιεκτικότητα του σε θειικούς πολυσακχαρίτες. Εάν η παραγωγή κριθεί επιτυχής και σε ικανοποιητικά επίπεδα, θα επιδιωχθεί περεταίρω να τροποποιηθεί στην πορεία ως προς το σκέλος των θρεπτικών ούτως ώστε να δοκιμαστεί (α) η σύνδεση της παραγωγής με την παροχή θαλασσινού νερού πλούσιου σε ανόργανα θρεπτικά από την έξοδο του βιολογικού φίλτρου της χερσαίας μονάδας εκτροφής θαλασσινών ιχθυδίων (0,2-3g/ind) της εταιρείας και (β) της απευθείας υποδοχής στις δεξαμενές των μακροφυκών των απορροών της διαδικασίας προπάχυνσης (ιχθύδια 3-8 g/ind). Ο στόχος είναι διττός: να επιτευχθεί οικονομικότερη παραγωγή μακροφυκών με την μείωση στο ελάχιστο της προσθήκης λιπασμάτων και η περεταίρω αποφόρτιση του απορρέοντος θαλάσσιου νερού από ανόργανα άλατα ούτως ώστε να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα πρόκλησης ευτροφισμού στο σημείο απορροής της μονάδας συμβάλλοντας τοιουτοτρόπως στην οικολογικά φιλική λειτουργία της. Η βιομάζα των μακροφυκών θα συλλέγεται, θα ζυγίζεται και θα ξηραίνεται με διαδικασία που αναπτύχθηκε σε προηγούμενο ερευνητικό πρόγραμμα και θα αποθηκεύεται σε σάκους τροφίμων σε κατάλληλες συνθήκες συντήρησης για περαιτέρω αξιοποίηση, ενώ δείγματα θα αποστέλλονται προς επεξεργασία και ανάλυση στον φορέα ΕΚΠΑ-ΦΑΡΜ.